Чтобы правильно выбрать терапию инфекционных заболеваний, необходимо определить тип возбудителя. Стандартные мазки и бактериологические тесты не всегда выявляют инфекцию, а вирусы не могут быть обнаружены в среде. Поэтому в гинекологии особенно используется ПЦР-анализ, который эффективен на этапе патологической диагностики и контроля лечения.
Полимеразная цепная реакция — метод молекулярной биохимии, разработанный в 1983 году американским ученым К. Маллисом. Однако ее основы были заложены еще в 1970 году норвежскими учеными, которые разработали метод построения копий молекул ДНК. Американский ученый усовершенствовал метод, который позволил воссоздать исходную молекулу любого генетического материала, обработав его специальным ферментом — ДНК-полимеразой. Этот метод произвел революцию в молекулярной биохимии, и в 1996 году К. Муллис получил Нобелевскую премию за свое изобретение.
Особенности исследования
ПЦР-диагностика отличается от других методов исследования. Небольшой фрагмент нуклеиновой кислоты копируется в искусственных условиях. Реакция запускается только тогда, когда тестовый образец содержит компонент ДНК, который соответствует определенным условиям.
Создание копий нуклеиновой кислоты похоже на аналогичный процесс в живом организме, за исключением того, что в клетках делается полный образец, а ПЦР запускает синтез небольшого короткого сегмента. Длина скопированных принципов в исследованиях не превышает 3000 пар, а у человека — более 3 миллиардов пар.
В медицинской практике используются различные виды тестов. Изначально ПЦР на ИППП позволяла определять только наличие возбудителей болезней. В настоящее время разработан количественный тест в реальном времени (ПЦР), который обнаруживает изменения в присутствии генетического материала в образце. Таким образом, результат отражает либо количество единиц, составляющих бактериальную колонию, либо количество вирусов.
Полимеразная цепная реакция в гинекологии используется для поиска следующих микроорганизмов:
- хламидии;
- уреаплазмы;
- Mycoplasma hominis и genitalium;
- трихомонады;
- гонококки;
- цитомегаловирус;
- герпес 1 и 2 типа;
- ВПЧ;
- гарднерелла;
- кандидоз.
Достоинства и недостатки методики
Полимеразная цепная реакция значительно упрощает диагностику инфекционных заболеваний у гинекологических больных. Достоинством теста является его высокая чувствительность. Некоторые заболевания могут быть латентными, не обнаруживаемыми мазком и бактериологом, но с периодическими клиническими симптомами. Для положительного результата достаточно всего нескольких фрагментов нуклеиновых кислот. Высокая чувствительность позволяет обнаруживать вирусные заболевания вскоре после заражения, когда клинических симптомов еще нет.
К другим положительным моментам можно отнести следующее:
- любой биологический материал подходит для тестирования;
- полнота — после взятия одной пробы можно провести тест на наличие множества микроорганизмов;
- высокая скорость — 5-7 часов достаточно для получения копии генетического материала, благодаря чему результат теста выдается в течение суток;
- высокая точность позволяет избежать ложноположительных или ложноотрицательных реакций, которые часто появляются в иммунологических тестах из-за перекрестных реакций;
- низкая стоимость реагентов делает тестирование доступным для большинства лабораторий и пациентов.
Недостатком комплексного ПЦР-теста являются высокие требования к получению биологического материала. Образцы должны быть собраны с использованием стерильных инструментов, в которых не будет внешних загрязнителей или других клеток. Помещение, где проводится анализ, должно быть оборудовано качественными фильтрами, очищающими воздух на 99,9% от микробов, вирусов и фрагментов ДНК. В противном случае результаты могут быть непредсказуемыми.
Какой материал используют для диагностики
При инфекциях, передающихся половым путем, у женщин мазок обычно берут из задней части влагалища или из уретры. Если выделения собираются из отверстия влагалища, анализ может быть некорректным. Большинство микробов селятся глубоко в складках слизистой оболочки. В области вульвы микрофлора влагалища может быть смешана с микроорганизмами с кожи, а ректальная флора может присутствовать у пациентов, которые ежедневно пользуются гигиеническими прокладками или интенсивно носят стринги.
Взять мазок на ПЦР-анализ
Мочу для анализа используют реже. Вирусные инфекции диагностируются по образцу крови.
У женщин, родивших детей с симптомами внутриутробной инфекции, после выкидыша для диагностики можно использовать сегмент плаценты и материал для аборта.
Показания для обследования
Мазок ПЦР рекомендуется при определенных показаниях:
- Определение состава возбудителей при имеющихся клинических симптомах острой инфекции.
- Хроническое воспаление половых органов с периодами обострения.
- Контрольно проведенное лечение.
Точная диагностика при всестороннем анализе позволяет выявить полный спектр возбудителей болезней и подобрать лекарства. Некоторые микроорганизмы чувствительны к узкому спектру антибиотиков. Например, трихомонаду можно лечить только метронидазолом. Если его не прописать в составе комбинированного режима, инфекция перейдет в хроническую форму. Но также профилактическое назначение антибиотиков плохо влияет на собственную микрофлору, увеличивает риск возникновения побочных эффектов.
ПЦР-диагностика рекомендуется женщинам с эрозией шейки матки или эктопией шейки матки. Воспалительный процесс в шейке матки часто связан с инфекцией вируса папилломы человека. ВПЧ типов 16, 18, 33 представляют собой высокий онкогенный риск и могут вызывать атипичную трансформацию клеток, которая перерастает в дисплазию и прогрессирует до рака шейки матки. Поэтому обследование, в ходе которого определяется тип возбудителя, необходимо для составления прогноза и выбора метода лечения.
Во время регистрации беременности тест проводится для выявления любых инфекций, которые могут повлиять на плод. Тест рекомендуется в случае положительных результатов иммунологических тестов, которые выявляют иммуноглобулины, свидетельствующие о наличии возбудителя. Воспроизведение копии ДНК объясняет присутствие патогена независимо от реакции организма на него.
Беременные женщины должны пройти обследование на цитомегаловирус. Первичное заражение при беременности приводит к выкидышу и серьезным порокам развития (о вреде цитомегаловируса при беременности мы уже говорили).
Подготовка пациентки
Чтобы получить точный результат, необходимо подготовиться к тесту, который зависит от типа тестируемого материала.
Кровь на анализ берут из вены строго натощак. Последний прием пищи должен быть вечером, оптимальный временной интервал перед сбором материала должен составлять не менее 8 часов. Плохо влияют на состав крови жирная и острая пища, алкоголь, некоторые лекарства.
Моча выделяется рано утром. Его необходимо собрать перед гигиеническими процедурами в стерильную емкость. Если качество собранной мочи вызывает сомнения, ее можно собрать через мочеточниковый катетер непосредственно из мочевого пузыря.
При ПЦР мазках из уретры или влагалища необходимо в течение нескольких дней воздерживаться от половых контактов. Запрещается проводить опрыскивание или другие обработки, которые могут изменить состав флоры. Результат может быть неточным. Запрещается мочиться за 2 часа до взятия пробы во избежание вымывания микроорганизмов струей мочи. Женщины не проходят тестирование во время менструации и в течение 2 дней после нее.
Как выполняется ПЦР
Метод взятия мазка мало чем отличается от обычных выделений из влагалища. Процедура проводится на гинекологическом кресле. Диагноз ставится в кратчайшие сроки, но исследуемый материал может храниться долгое время.
Сама реакция состоит из нескольких этапов. Это делается в специальном устройстве — усилителе. Есть циклы нагрева и охлаждения с высокой точностью температуры. В смесь добавляют вазелиновое масло для предотвращения испарения биологического материала.
Для полимеразной цепной реакции используются следующие компоненты:
- Матрица ДНК, содержащая участок нуклеиновой кислоты, который необходимо реплицировать;
- два праймера — короткие участки нуклеотидов, необходимые для воссоздания цепи матрицы;
- термостабильный фермент ДНК-полимераза;
- нуклеозид фосфаты;
- магний в ионном состоянии;
- буферный раствор, обеспечивающий необходимую кислотность среды, содержит соли бычьего сывороточного альбумина.
Весь тест проходит в три этапа. Сначала проводится денатурация. Матрица ДНК нагревается до температуры 98 ° C, благодаря чему две ее нити разделяются. Достаточно времени прогрева от 30 секунд до 2 минут. Во время денатурации водородные связи в молекуле разрываются, и структура двойной спирали утрачивается. В некоторых случаях также проводится предварительный нагрев шпал. Этот тип теста называется горячим стартом и помогает уменьшить количество побочных продуктов реакции.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
После денатурации начинается отжиг. В это время температура смеси начинает снижаться. Обычно она понижается на 4-5 ° C по сравнению с начальной температурой. Праймеры прикреплены к одноцепочечной ДНК. Они подбираются с определенным составом, который помогает выделить и определить исследуемый участок нуклеиновой кислоты. Этот шаг занимает от 0,5 до 2 минут. Если температура неправильная, праймеры могут не связываться с правильным участком молекулы или они могут связываться в неправильном месте и создавать неправильные продукты.
Завершающий этап — удлинение. На этом этапе выбирается оптимальная температура для использования дезоксинуклеотидтрифосфата. Это занимает около 1 минуты на каждую тысячу созданных пар оснований. Этот шаг занимает от 7 до 10 минут.
Этот цикл повторяется несколько раз.
Как долго длится экзамен?
Все зависит от поиска конкретного возбудителя, характера пробы и количества разыскиваемых инфекций. Для получения ответа требуется минимум 30 полных циклов амплификации, при этом один цикл занимает до 15 минут. Поэтому на получение результата уходит до 7 часов, а иногда и больше. Ответ выдается пациенту или отправляется лечащему врачу не позднее, чем через сутки после сбора материала.
Результаты анализа и их расшифровка
То, что показывает тест ПЦР, зависит от цели теста. В качественных тестах на форме отмечается наличие или отсутствие ДНК искомого возбудителя. Положительный результат указывает на наличие инфекции, а отрицательный результат указывает на отсутствие генетического материала.
Количественная ПЦР позволяет в реальном времени определять количество молекул ДНК патогена. Это необходимо для диагностики условно-патогенных микроорганизмов, не требующих лечения в низких концентрациях. Такой подход используется при диагностике мочевины и микоплазм.
Хламидии
Тестирование на разные виды инфекции имеет свои особенности и показания. ПЦР-анализ на хламидиоз проводится чаще других. Это связано с широким распространением инфекции, бессимптомным течением у 60% женщин и большим количеством осложнений хронического инфекционного процесса. Обследование рекомендуется в следующих случаях:
- острые симптомы вульвовагинита неясной этиологии;
- Диагностика причины хронического воспаления половых органов;
- бесплодие;
- контроль эффективности лечения;
- Скрининговые тесты.
Скрининговые тесты необходимы пациентам из группы риска, чтобы исключить бессимптомную передачу хламидиоза. Контроль излечимости проводится не ранее, чем через месяц после окончания антибактериальной терапии.
Беременным женщинам следует пройти тест ИФА для определения наличия антихламидийных антител. Рекомендуется проводить этот тест в предконтрацептивный период, чтобы обеспечить лечение до беременности и снизить риск осложнений, связанных с самим возбудителем и применением антибиотиков.
Уреаплазмы
Уреаплазмоз относится к инфекциям, вызванным условно-патогенной микрофлорой. Лечение не начинают, если это число меньше 10X4 КОЕ. Но при наличии клинических симптомов хронического воспаления, которое плохо лечится, беременным назначают антибактериальную терапию. Оптимально пройти обследование при планировании беременности, чтобы снизить риск для плода. ПЦР на уреаплазмоз — один из обязательных тестов при бесплодии.
ВПЧ
Папилломавирусы приводят к предраковому поражению шейки матки, но не все типы имеют этот потенциал. 16 и 18 типы характеризуются высоким онкогенным риском, несколько ниже 33, 31, 51, 52 и других. С другой стороны, ВПЧ типов 6, 11, 42 вызывают острые остроконечные кондиломы и редко встречаются при злокачественных новообразованиях. Этот тест необходим при дисплазии шейки матки и является частью скринингового теста.
Герпес
Для исследования можно использовать не только кровь, но и соскобы со слизистой половых органов. Исследование проводится:
- при подготовке к беременности;
- Известная ВИЧ-инфекция;
- боль при мочеиспускании и отсутствие признаков бактериальной инфекции;
- в дифференциальной диагностике половых инфекций.
Вирус обнаруживается в крови на 4-е сутки после заражения. Это хроническая инфекция, которая может иметь длительный период ремиссии и оставаться в спящем состоянии в спинномозговых ганглиях.
Candida
В 15% случаев кандидоз мочеполовой системы носит хронический характер. Иногда грибковые клетки или гифы не обнаруживаются в мазке, когда возникает зуд и жжение. Обследование и последующая расшифровка мазка ПЦР помогает определить грибковую инфекцию. Анализ позволяет определить тип Candida для подбора противогрибковых препаратов.
Трихомонада
Одноклеточный микроорганизм не всегда можно обнаружить в мазке, но у женщины будут симптомы хронического воспаления, чувство зуда и жжения в половых органах. Обследование необходимо при поиске причин бесплодия, цистита, эндометрита неясной этиологии и длительного воспаления.
В гинекологии тест ПЦР используется как часть комплексной диагностики ИППП. Это надежный метод определения возбудителя по фрагментам ДНК. Собирается венозная кровь или выделения из влагалища. Продолжительность анализа — один день.
Часто возникает необходимость проверить иммунный ответ организма на инфекцию, и возраст заражения и стадия заболевания могут быть определены по наличию специфических антител, что не допускается с помощью ПЦР.
